Bases para un tratamiento con hipertermia moderada en leishmaniosis cutánea / Bases for a treatment of cutaneous leishmaniasis with moderate hyperthermia

Resumen Introducción: La hipertermia regional entre 38 y 39.5 °C ha sido empleada para tratar procesos inflamatorios y, ocasionalmente, infecciones cutáneas. En zonas endémicas de leishmaniosis se aplican compresas calientes como tratamiento antiparasitario. Objetivo: Conocer las bases del tratamiento térmico de la leishmaniosis para regularlo adecuadamente. Métodos: Parásitos Leishmania mexicana cultivados in vitro fueron incubados por periodos variables de 37 °C y después a 25 °C.. Los parásitos se tiñeron con anexina V-FITC y yoduro de propidio para detectar inducción de apoptosis y su viabilidad. Se realizaron curvas de crecimiento postratamiento e identificación del ciclo celular con anticuerpos anticiclinas. Resultados: Después de 30 minutos de exposición a una temperatura de 37 °C, un porcentaje variable de parásitos perdieron su característica forma ovalada y se tornaron esféricos, sin refringencia y con núcleos condensados, cambios que sugirieron apoptosis, la cual fue confirmada mediante tinción con anexina V-FITC. La cantidad de parásitos en proceso de apoptosis fue proporcional al tiempo de exposición. Los parásitos en los que se observó apoptosis se tiñeron con anticuerpos anticiclinas. Conclusiones: La elevación constante, regulada y fisiológica de la temperatura por más de 30 minutos induce apoptosis de parásitos Leishmania mexicana cultivados in vitro, cuando se encuentran en fase activa en el ciclo celular.

Abstract Introduction: Regional hyperthermia at between 38 and 39.5 °C has been used to treat inflammatory processes and, occasionally, skin infections. In areas where leishmaniasis is endemic, hot compresses are applied as anti-parasitic treatment. Objective: To identify the bases of leishmaniasis thermal treatment in order to properly regulate it. Methods: In vitro-cultured Leishmania mexicana parasites were incubated for variable periods at 37 and then, to 25 °C. The parasites were then stained with Annexin V-FITC to detect apoptosis induction and with propidium iodide for viability. Post-treatment growth curves and cell cycle identification with anti-cyclin antibodies were performed. Results: After 30 minutes of exposure to a temperature of 37 °C, a variable proportion of parasites lost their characteristic oval shape and became spherical, without refringence and with condensed nuclei, with these changes suggesting apoptosis, which was confirmed by Annexin V-FITC staining. The number of parasites that underwent apoptosis was proportional to exposure time. Parasites in which apoptosis was observed were stained with anti-cyclin antibodies. Conclusions: Constant, regulated and physiological elevation of temperature for more than 30 minutes induces apoptosis of in vitro-cultured L. mexicana parasites when they are in an active phase of the cell cycle.

Report of autochthonous cases of localized cutaneous leishmaniasis caused by Leishmania (Leishmania) mexicana in vulnerable, susceptible areas of Southeastern Mexico

ABSTRACT Localized cutaneous leishmaniasis (LCL) is an endemic disease in several Mexican States with the main endemic areas located in the South-Southeast region of the country, where 90% of Leishmania (Leishmania) mexicana cases are registered. The Southeast region is located in the Yucatan Peninsula, including Campeche, Quintana Roo and Yucatan States. Campeche and Quintana Roo register more than 60% of the cases in the country each year, while in Yucatan the reports are of imported cases due to residents traveling to endemic areas. However, since 2015, autochthonous cases have been diagnosed by health authorities in municipalities with no previous transmission records. We aimed to identify Leishmania parasite species involved in autochthonous cases by means of the PCR technique. The present study included 13 autochthonous cases of LCL with clinical and parasitological diagnoses during 2018 and 2019 by health authorities, without specific identification of the causal agent. Tissue samples were taken by scraping the margins of active lesions and then they were spotted onto an FTATM Elute Microcard. Next, DNA was eluted and used for PCR amplification of specific Leishmania genus and L. (L.) mexicana species-specific fragments. Molecular analysis showed evidence that L. (L.) mexicana was the causal agent of LCL in 12 of the 13 patients; in one patient, PCR was not performed due to the patient's refusal to participate in the study. Identifying Leishmania species that cause LCL is necessary to define efficient treatment schemes and control strategies for the disease in vulnerable and susceptible areas of the Yucatan State's municipalities.

Development of Leishmania mexicana in Lutzomyia longipalpis in the absence of sugar feeding

The leishmaniases are caused by Leishmania parasites and transmitted through the bites of phlebotomine sand flies. During parasite development inside the vector's midgut, promastigotes move towards the stomodeal valve, a mechanism that is crucial for transmission. It has been reported that the sugar meal acquired by sand flies during feeding between bloodmeals is essential for the development and migration of parasites. We demonstrated that the distribution of Leishmania mexicana parasites was affected by the sugar meals obtained by the sand flies. Promastigote migration towards the cardia region seems to be only partially based on the stimuli provided by sugar molecules. In the absence of sugars, significant amounts of parasites developed in the hindgut. In addition, sugar meals were important for the survival of sand flies, especially during blood digestion, presumably supporting their energy requirements.

Efecto de extractos metanólicos de semillas de Carica papaya sobre promastigotes de Leishmania mexicana / Effect of methanolic extracts of Carica papaya seeds on promastigotes of Leishmania mexicana

La leishmaniasis comprende un grupo de enfermedades infecciosas causadas por parásitos protozoarios pertenecientes al género Leishmania, siendo un problema de salud pública alrededor del mundo. Esta enfermedad prevalece en 98 países tropicales con un estimado de 2 millones de casos nuevos por año. El control de la enfermedad es deficiente, ya que los tratamientos disponibles no son satisfactorios debido a la alta toxicidad, la generación de resistencia por los parásitos y los altos costos del tratamiento. Por lo tanto, se busca desarrollar nuevas alternativas terapéuticas para tratar la enfermedad. Los productos naturales constituyen una fuente ilimitada para la obtención de productos químicos que sirven de base para el desarrollo de nuevas drogas. Diversos extractos de plantas han mostrado actividad antiparasitaria, entre los cuales se encuentran los extractos de Carica papaya. Esta planta perteneciente a la familia Caricaceae, tiene una amplia gama de propiedades medicinales. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto de extractos metanólicos de semillas de Carica papaya sobre promastigotes de Leishmania mexicana. Las semillas se secaron, se molieron y el polvo obtenido se maceró en metanol. El extracto se filtró, se concentró en un rotoevaporador y se resuspendió en dimetilsulfóxido (DMSO). Diversos compuestos fitoquímicos se lograron identificar en el extracto metanólico, tales como alcaloides, compuestos fenólicos, flavonoides, glicósidos cianogénicos, taninos y triterpenos. Los ensayos de citotoxicidad mediante el método de reducción de la sal de tetrazolio (MTT) revelaron un efecto citotóxico de los extractos contra los promastigotes (IC50= 0,18± 0,02 mg/ml) y un efecto inhibitorio del crecimiento de cultivos de promastigotes (IC50= 0,20± 0,05 mg/ml). Los extractos mostraron una menor actividad citotóxica sobre macrófagos murinos J774 con IC50 de 6,75 mg/ml, calculándose un Índice de Selectividad de 37. Los estudios por microscopía de contraste de fase, revelaron alteraciones en la morfología celular, la movilidad flagelar y la citocinesis de los promastigotes tratados con los extractos. Los resultados demuestran que los extractos metanólicos de semilla inhiben el crecimiento y causan alteraciones estructurales en promastigotes de L. mexicana, proporcionando nuevas perspectivas en el desarrollo de drogas con actividad antileishmanial obtenidas de productos naturales. Palabras clave: Leishmania mexicana, Carica Papaya, extracto metanólico, citotoxicidad.

Preliminary study towards a novel experimental model to study localized cutaneous leishmaniasis caused bY Leishmania (Leishmania) mexicana / Estudio preliminar sobre un nuevo y original modelo experimental de leishmaniosis cutánea localizada causada por Leishmania (Leishmania) mexicana

There is not an experimental model of localized cutaneous leishmaniasis (LCL) caused by Leishmania (Leishmania) mexicana. The aim of the present study was to characterize the clinical and histological features of Peromyscus yucatanicus experimentally infected with L. (L.) mexicana. A total of 54 P. yucatanicus (groups of 18) were inoculated with 1x10(6) promastigotes of L. (L.) mexicana in the base of the tail. They were euthanized at three and six months post experimental infection. The control group was inoculated with RPMI-1640. The predominant clinical sign observed was a single ulcerated lesion in 27.77% (5/18) and in 11.11% (2/18) P. yucatanicus at three and six months respectively. The histological pattern described as chronic granulomatous inflammation with or without necrosis was found in 7/7 (100%) biopsies of euthanized P. yucatanicus at three (n = 5) and six (n = 2) months, respectively. These results resembled clinical and histological features caused by L. (L.) mexicana in humans, and support the possibility to employ P. yucatanicus as a novel experimental model to study LCL caused by this parasite.

No existe un modelo experimental de la leishmaniosis cutánea localizada (LCL) causada por Leishmania (Leishmania) mexicana. El objetivo del presente estudio fue el de caracterizar los cuadros clínico e histológico de Peromyscus yucatanicus infectados experimentalmente con L. (L.) mexicana. Un total de 54 P. yucatanicus (grupos de 18) fueron inoculados en la base de la cola con 1x10(6) promastigotes de L. (L.) mexicana. A los 3 y 6 meses posteriores a la infección experimental fueron sacrificados. El grupo control fue inoculado con RPMI-1640. El signo clínico predominante fue una lesión única ulcerada en 27.77% (5/18) y en 11.11% (2/18) P. yucatanicus a los 3 y 6 meses respectivamente. El patrón histológico descrito como inflamación crónica granulomatosa con o sin necrosis se observó en 7/7 (100%) biopsias de los P. yucatanicus a los 3 (n=5) y 6 (n=2) meses respectivamente. Los resultados son similares a los cuadros clínico e histológico de la infección por L. (L.) mexicana en humanos, y apoyan la posibilidad de utilizar P. yucatanicus como un nuevo y original modelo para el estudio de la LCL causada por L. (L.) mexicana.

Determinación de la especificidad de IgA sérica producida en respuesta a antígenos de Leishmania (Leishmania) mexicana en leishmaniosis murina / Determination of the specificity of seric IgA produced in response to antigens of Leishmania (Leishmania) mexicana in murine leishmaniasis

En la leishmaniosis experimental, la función de los anticuerpos no está completamente clara, ya que algunos autores consideran que dichas proteínas no participan en la protección contra la infección; sin embargo, estudios histopatológicos en lesiones con leishmaniosis humana y experimental, muestran infiltrados de células plasmáticas positivas para IgA y secreción de IgM, IgG e IgA que podrían mediar la formación de complejos inmunológicos con antígenos parasitarios o propios, favoreciendo la necrosis lo que conlleva a la eliminación del parásito. En este trabajo se determinó si la IgA sérica en el modelo murino posee reactividad específica contra antígenos de Leishmania (Leishmania) mexicana de utilidad diagnóstica. Para ello, se utilizaron ratones susceptibles y resistentes a leishmaniosis cutánea, demostrándose mediante ELISA indirecta que la IgA sérica de ratones susceptibles es elevada en comparación con la producida por ratones resistentes. Aunque otros estudios en modelos murinos demuestran que la IgG sérica de ratones infectados con L. (L) mexicana presenta reactividad cruzada con antígenos parasitarios no relacionados obtenidos de Trypanosoma cruzi, al analizar la especificidad de IgA por antígenos de L. (L) mexicana y T. cruzi, mediante Western Blot, se demostró que la IgA sérica de ratones infectados con T. cruzi también reaccionan con antígenos de L. (L) mexicana, estos hallazgos sugieren que la IgA puede ser útil para el manejo clínico y pronóstico de la enfermedad.

In experimental leishmaniasis, the role of antibodies is not entirely clear, as some authors consider that these proteins are not involved in protection against infection. However, histopathological studies in human and experimental leishmaniasis lesions, show plasma cell infiltrates positive for IgA and secretion of IgM, IgG and IgA could mediate the formation of immune complexes with parasite antigens or self components, favoring necrosis leading to the elimination of the parasite. In this study, we determined if the serum IgA in the murine model has specific reactivity against antigens of Leishmania (Leishmania) mexicana of diagnostic utility. To do this, we used mice either susceptible or resistant to cutaneous leishmaniasis, and demonstrated by indirect ELISA that serum IgA is elevated in susceptible mice compared with that produced by resistant mice. Although other studies in murine models show that the serum IgG from mice infected with L. (L) mexicana present cross reactivity with unrelated parasite antigens derived from Trypanosoma cruzi, the analysis of the specificity of IgA by antigens of L. (L) mexicana and T. cruzi, by Western Blot, showed that the IgA serum of mice infected with T. cruzi reacts too with antigens of L. (L) mexicana. These findings suggest that IgA may be useful for the clinical management and prognosis of the disease.

Reacción de antígenos de Leishmania (Leishmania) mexicana con sueros de pacientes con leishmaniosis cutánea de Sinaloa, México / Reaction of Leishmania (Leishmania) mexicana antigens by sera of patients with cutaneous leishmaniasis from Sinaloa, Mexico

OBJETIVO: Detectar los antígenos de Leishmania (Leishmania) mexicana que reaccionan con sueros de pacientes con leishmaniosis cutánea (LC) de Sinaloa, México. MATERIAL Y MÉTODOS: Un extracto crudo de L. (L.) mexicana fue usado como antígeno para Western blots 2-D empleando sueros de cinco pacientes con LC y controles originarios de Sinaloa, México, durante el 2008. RESULTADOS: Cinco antígenos fueron detectados sólo por los sueros de los cinco pacientes estudiados; estos son: 26 kDa (pI 7.8), 27 kDa (pI 8.1), 28 kDa (pI 8.6), 29 kDa (pI 8.5) y 31 kDa (pI 9.0). CONCLUSIONES: Se detectaron nuevos antígenos de L. (L.) mexicana potencialmente inmunodominantes, lo que sugiere a este parásito como el agente causal de la LC en Sinaloa.

OBJECTIVE: To detect Leishmania mexicana antigens reacting with sera of patients with cutaneous leishmaniasis (CL). MATERIAL AND METHODS: A crude extract of L. mexicana was used as antigen for 2-D Western blot using sera from 5 patients with CL and controls from Sinaloa, Mexico during 2008. RESULTS: Five antigens were detected in the five infected patients analyzed; their molecular weights and isoelectric points were: 26 kDa (pI 7.8), 27 kDa (pI 8.1), 28 kDa (pI 8.6), 29 kDa (pI 8.5) and 31 kDa (pI 9.0). CONCLUSION: New potentially immunodominant L. mexicana antigens were detected, suggesting that this parasite could be the species responsible for human infection in Sinaloa.

Comparison of small mammal prevalence of Leishmania (Leishmania) mexicana in five foci of cutaneous leishmaniasis in the State of Campeche, Mexico / Comparación de las prevalencias de Leishmania (Leishmania) mexicana en mamíferos pequeños en cinco focos de leishmaniosis cutánea en el estado de Campeche, México

In the Yucatan Peninsula of Mexico, 95% of the human cases of Cutaneous Leishmaniasis are caused by Leishmania (Leishmania) mexicana with an incidence rate of 5.08 per 100,000 inhabitants. Transmission is limited to the winter months (November to March). One study on wild rodents has incriminated Ototylomys phyllotis and Peromyscus yucatanicus as primary reservoirs of L. (L.) mexicana in the focus of La Libertad, Campeche. In the present study, the prevalence of both infection and disease caused by L. (L.) mexicana in small terrestrial mammals were documented during five transmission seasons (1994-2004) in five foci of Leishmaniasis in the state of Campeche. Foci separated by only 100 km, with similar relative abundances of small mammals, were found to differ significantly in their prevalence of both symptoms and infection. Transmission rates and reservoir species seemed to change in space as well as in time which limited the implementation of effective control measures of the disease even in a small endemic area such as the south of the Yucatan Peninsula.

En la Península de Yucatán, México, la Leishmaniosis Cutánea es causada por Leishmania (L.) mexicana en 95% de los casos humanos, con una incidencia de 5.08% por cada 100,000 habitantes. El ciclo de transmisión se limita a la estación de invierno (noviembre- marzo). Un estudio de mamíferos silvestres incrimina a Ototylomys phyllotis y Peromyscus yucatanicus como reservorios primarios de L. (L.) mexicana en el foco de infección de La Libertad, Campeche. En el presente estudio, se documenta la prevalencia de infección/enfermedad causada por L. (L.) mexicana en pequeños mamíferos, durante cinco estaciones de transmisión (1994-2004) en cinco focos de CL del estado de Campeche. Los focos separados por solamente 100 km. de distancia, aún cuando tienen abundancias relativas de pequeños roedores similares, fueron significativamente diferentes en relación a la prevalencia de síntomas así como de infección. Las tasas de transmisión y las especies de reservorios parecen estar cambiando tanto en el tiempo como en el espacio, lo cual impide el establecimiento de adecuadas medidas de control de la enfermedad aún en un área endémica tan pequeña como lo es el sur de la Península de Yucatán.

Diseminación tisular y efectos histopatológicos producidos por Leishmania mexicana amazonensis en roedores infectados experimentalmente / Tissue dissemination and histopathology effects produced by Leishmania mexicana amazonensis in rodents experimentally infected

Al género Leishmania pertenecen diferentes especies responsables de diversas formas clínicas de leishmaniasis. En este trabajo comparamos los efectos histopatológicos producidos en hamsters (Mesocricetus auratus) y ratones (Mus musculus) infectados experimentalmente por vía subcutánea con 20 x 10(5) amastigotes de Leishmania mexicana amazonensis. Nuestros resultados mostraron en hamsters daños histopatológicos en intestino, escroto, testículo, epidídimo, bazo, hígado, riñón, corazón y pulmón y en ratones en testículo, bazo, riñón y corazón. Estos resultados evidencian diferencias en la diseminación tisular, metástasis cutáneas, efectos histopatológicos y mortalidad, siendo más amplios, tempranos y graves en hamsters que en ratones.

Leishmania comprises different species responsible of a variety of clinical forms of leishmaniasis. In this investigation we compared the histopathological effects produced in hamsters (Mesocricetus auratus) and mice (Mus musculus), inoculated by the subcutaneous route with 20 x 10(5) amastigotes of Leishmania mexicana amazonensis. Our results in hamsters show tissue damage in gut, scrotum, testicle, epididimus, spleen, liver, kidney, heart and lung and in mice we found histopathological changes in testicle, spleen, kidney and heart. These results show differences on tissue dissemination, cutaneous metastasis, histopathological effects and mortality, being more extensive, early and severe in hamsters then in mice.

El ADN de Leishmania mexicana activa al macrófago murino e induce aumento en la expresión de TLR9 / Leishmania mexicana DNA activates murine macrophages and increases their TLR9 expression

Antecedentes: Los macrófagos son células de la respuesta inmune que reconocen patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) mediante receptores presentes en la superficie de la célula como en compartimentos intracelulares, como los TLR (toll like receptors). Distintos TLR reconocen ligandos que comparten múltiples patógenos. La unión de TLR con su ligando desencadena una cascada de señalización que termina en la producción de citocinas y moléculas coestimuladoras a través de la translocación de NF-κB al núcleo. Nuestro grupo demostró que el lipofosfoglucano de Leishmania es un ligando de TLR2 que activa células NK. Schieicher y cols.12 informo recientemente la activación de células dendríticas plasmacitoides con ADN genómico de Leishmania infantum a través de TLR9, con alta producción de IFN tipo I. Objetivo: En el presente trabajo exploramos si el ADN de Leishmania mexicana contiene motivos CpG no metilados capaces de activar al macrófago murino derivado de médula ósea, como ha sido descrito anteriormente para motivos CpG no metilados de ADN bacteriano. Resultados y conclusiones: Encontramos que el ADN de Leishmania mexicana posee motivos CpG no metilados que activan macrófagos murinos de la cepa BALB/c, llevando a la producción de citocinas proinflamatorias como TNFα e IL12P40 y a la sobreexpresión del mARN de TLR9.

BACKGROUND: Macrophages are immune system cells that recognize pathogen associated molecular patterns (PAMPs) through receptors that can be located on the cell membrane or in intracellular compartments, such as the TLR (toll like receptors). Different TLRs bind to ligands shared among multiple pathogens. The binding of ligands to TLRs induces a signaling cascade that leads to cytokine and co-stimulatory molecule production due to the nuclear translocation of NF-kappaB. We demonstrated that Leishmania lipophosphoglycan (LPG) is a ligand for TLR2, leading to NK-cell activation. Schieicher et al. recently reported that genomic DNA from Leishmania infantum activates plasmacitoid dendritic cells through TLR9, leading to IFN type I production. OBJECTIVE: In the present study we explored wether Leishmania mexicana DNA contained non-methylated CpG motifs able to activate murine bone marrow derived macrophages, as previously described for bacterial DNA containing CpG motifs. RESULTS AND CONCLUSIONS: We observed that Leishmania mexicana DNA contains non-methylated CpG morifs able ofactivating murine bone marrow derived macrophages, leading to the production of proinflammatory cytokines such as TNFalpha and IL- 12(P40) as well as the over expression of mRNA for TLR9.